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Il film inizia con una veduta della Terra dallo spazio e con il capo dei Chitauri che, parlando con un antico dell'universo, brama la conquista del pianeta e la sottomissione della razza umana con l'aiuto di Loki. Nella scena successiva il colonnello Nick Fury, direttore dello S.H.I.E.L.D. (Strategic Homeland Intervention, Enforcement & Logistic Division), raggiunge un complesso dove sono situati laboratori sperimentali dello S.H.I.E.L.D., all'interno della quale il dottor Erik Selvig sta effettuando dei test sul Cubo Cosmico (o Tesseract) recuperato da Howard Stark negli anni cinquanta nell'oceano atlantico settentrionale, il tutto sotto lo sguardo dell'agente Clint Barton (Occhio di Falco). Improvvisamente il Tesseract apre un varco dimensionale ed appare Loki, che impugna uno strano scettro con una gemma blu incastonata in cima. Alla richiesta di deporre l'arma, Loki uccide gran parte degli agenti presenti, compie un incantesimo sul Dr. Selvig ed Occhio di Falco e fugge impadronendosi del Tesseract, mentre a nulla valgono i tentativi del colonnello Nick Fury e dell'agente S.H.I.E.L.D. Maria Hill per recuperarlo. Essendo un allarme di livello 7, Nick Fury mette in atto le contromosse e invia l'agente S.H.I.E.L.D. Coulson a richiamare al quartier generale S.H.I.E.L.D. un gruppo di persone già note alle cartelle di Fury, che ha l'intento di creare una squadra d'azione "speciale". Steve Rogers/Capitan America, Bruce Banner/Hulk, Tony Stark/Iron Man e Natasha Romanoff/Vedova Nera si incontrano sull'Helicarrier, un enorme portaerei dotata di tecnologia sofisticata come quattro giganteschi rotori in grado di alzarla in volo dall'oceano e di un sistema di mimetizzazione che la fa svanire rendendola invisibile (è questo, l'Helicarrier, il quartier generale dello S.H.I.E.L.D. ). Intanto Loki manifesta le sue intenzioni: vuole iniziare una guerra, con un esercito alieno (i Chitauri) a suo seguito, mentre deve recuperare il Tesseract per qualcuno che lo ha fornito dell'esercito e dello scettro, altrimenti sperimenterà una nuova forma di dolore. Per comunicare sulla Terra, questo misterioso individuo usa il capo dei Chitauri come portavoce, che si mette in contatto con Loki tramite lo scettro.
Il dio dell'inganno viene in poco tempo individuato dallo S.H.I.E.L.D., a Stoccarda, e dopo un breve scontro con Iron Man e Captain America, riescono a catturarlo. Durante il ritorno alla base, Thor appare improvvisamente dal cielo sul QuinJet dello S.H.I.E.L.D. e requisisce con la forza Loki. Il dio del tuono intende portarlo con sé e sottoporlo al giudizio Asgardiano, ma Iron Man, deciso a recuperare il prigioniero, interrompe bruscamente il dibattito tra le due divinità. Lo scontro fra i due eroi sembra ben lontano dalla conclusione (Thor è più forte, ma i suoi fulmini non fanno altro che potenziare l'armatura di Stark), ma l'intervento di Capitan America riesce a placare gli animi. Tornati all'Helicarrier, si manifestano screzi ed incomprensioni. Vi sono perplessità sulla coesione del gruppo (la presenza del dottor Bruce Banner rende inoltre tutti un po' irrequieti, ma Banner sembra aver sviluppato un notevole autocontrollo sulla rabbia che in lui scatena la trasformazione in Hulk) e diffidenza verso le reali intenzioni dello S.H.I.E.L.D.. In breve tempo, infatti, vengono trovati dagli eroi prototipi e progetti di armi di distruzione di massa. Nick Fury rivela che da quando è stata scoperta l'esistenza di altri mondi (dalla prima venuta di Thor), è stato deciso un serio potenziamento militare allo scopo di farsi trovare più evoluti in un possibile scontro con civiltà sconosciute. Durante questo momento di distrazione, Clint Burton/Occhio di Falco e altri agenti posseduti dall'incantesimo di Loki assaltano l'Helicarrier per liberare il dio dell'inganno dalla sua prigione. Nella confusione in seguito ad un'esplosione, Bruce Banner inizia a perdere il suo autocontrollo. A nulla valgono i tentativi di Natasha di placare il dott. Banner che si trasforma in Hulk, e con una rabbia incontrollabile si scaglia contro la Vedova Nera. Solo l'intervento di Thor salva la donna. Dopo un'equa colluttazione, Hulk, nel tentativo di distruggere un cacciabombardiere, precipita dalla base. Iron Man e Capitan America tentano insieme di far ripartire i motori distrutti dell'Elivelivolo, mentre Loki, liberato dai suoi uomini, imprigiona ed espelle dalla nave Thor, uccide l'Agente S.H.I.E.L.D. Coulson, venuto in soccorso del dio del tuono, e fugge nuovamente. Intanto, a causa di una tremenda botta in testa da parte di Natasha, l'agente Clint Burton rinviene dall'incantesimo di Loki. Hulk e Thor sono dispersi. Tuttavia la morte dell'agente Coulson, amico di Stark e Thor, e grande ammiratore di Capitan America, crea coesione tra gli eroi e dà loro la giusta motivazione per combattere insieme contro il comune nemico.
Stark capisce che il piano di Loki prevedeva farsi arrestare e ragiona su dove possa essere il Tesseract e intuisce che l'Asgardiano vorrà portare a termine il suo piano in modo plateale, così che tutti lo possano ammirare. Il punto scelto per installare i Tessaract non può che essere che il più alto della città, ovvero la Stark Tower a New York City. Giunto sul posto, Iron Man incontra Loki e il Dr. Selvig sul tetto della Stark Tower. Dopo un breve confronto all'aperto, Tony Stark atterra sulla Stark Tower e si libera dell'armatura danneggiata di Iron Man e colloquia amichevolmente con Loki per distrarlo mentre indossa un paio di bracciali che comandano a distanza la nuova armatura Iron Man denominata Mark 7, e Loki punta sul petto di Stark lo scettro per praticare un incantesimo su Stark fallendo nel tentativo cosi Loki non riuscendo a compiere l'incantesimo scaglia Stark giù dalla torre, ma il comando a distanza della nuova armatura "Mark 7" di Iron Man viene guidata dai bracciali ai polsi di Tony e lo raggiunge, così gli si indossa in volo appena in tempo e colpisce Loki sparandolo. Però il portale spaziale si apre ed escono i Chitauri che assalgono New York City, così i rappresentanti del governo statunitense ordinano il decollo di un jet armato con un missile contenente un ordigno nucleare: è loro intenzione distruggere l'intera città per poter contenere l'invasione aliena.
Uno ad uno tutti i Vendicatori si lanciano nella battaglia, compreso Banner, che sopraggiunto in tempo rivela di riuscire a controllare la sua trasformazione ed a riconoscere gli altri eroi come suoi alleati. Thor raggiunge Loki e prova a farlo ragionare, e, per un istante, Loki sembra ravvedersi, ma poi, esitante, ferisce il fratellastro e fugge. Benché i Vendicatori abbiano la meglio degli invasori Chitauri di Loki, finché il varco rimane aperto i rinforzi alieni continuano ad affluire. Hulk raggiunge Loki sulla Stark Tower e, nonostante gli altezzosi proclami dell'Asgardiano, lo sconfigge duramente. Vedova Nera raccoglie lo scettro, unica chiave per poter chiudere il portale. Nel frattempo il Jet inviato dal governo ha sparato il missile dotato dell'ordigno nucleare e Iron Man, in un atto di estremo sacrificio, usa tutte le forze per deviare il missile attraversando il portale e lo scaglia contro la nave madre dei Chitauri, spegnendo l'esercito nemico. Stark si trova nel cosmo e quindi non riesce a respirare e muore, ma fortunatamente spinto dall'onda d'urto dell'esplosione, riesce ad oltrepassare nuovamente il portale prima che si chiuda definitivamente, e mentre precipita viene raccolto al volo da Hulk. Cessata la minaccia, Thor torna ad Asgard con il Tesseract e Loki prigioniero. Gli altri Vendicatori riprendono le loro rispettive strade, in caso di nuova minaccia il gruppo tornerà unito, dato che la gente sa che gli eroi non sono un pericolo ma preziosi difensori del mondo.
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